Transport Mode
High-speed rail transportation
1. Shockproof foam box transportation.
2. Fix the insulated box on the car floor's anti-slip groove to avoid shifting during sudden braking or acceleration.
3. Express delivery after arriving at the high-speed railway station.
Reference Citation
pass over.
Scope of Application
The scientific research uses of islet cells mainly include the following:
Diabetes mechanism and therapeutic research: for analyzing the pathological mechanisms of type 1/type 2 diabetes, such as defective pancreatic β-cell function or insulin resistance, and developing cell replacement therapies (e.g., islet cell transplantation with stem cell differentiation).
Regenerative medicine and cell therapy: transform somatic cells into pluripotent stem cells through chemical reprogramming, and then differentiate them into functional islet cells to achieve a functional cure for diabetes, e.g., RGB-5088 injection of Ripchentron is able to get rid of insulin dependence through autologous cell transplantation.
Drug screening and toxicity assessment: as an in vitro model to test the effect of drugs on insulin secretion, glucose metabolism, or to assess drug nephrotoxicity (e.g. diabetic nephropathy research).
Metabolic regulation and signaling pathway research: to investigate the role of pancreatic islet α/β cells in glucose, fat and protein metabolism, as well as the regulation of cellular function maturation by pathways such as TGF-β, Wnt and ceramide metabolism.
Disease model construction: using primary islet cells or pluripotent stem cell-derived islet cells to construct in vitro models to simulate diabetes progression and complication mechanisms.
These studies not only advance the treatment of diabetes (e.g., clinical transplantation and functional cure), but also expand into the fields of metabolic diseases and drug development.
Due to biannual updates of our product instruction manual, the following procedures are for reference only.
The most recent version included with the product shall prevail.
II 试剂与材料
Ø 胰岛细胞（Cat# LV-Lslet001/2/3/4）
Ø 胰岛细胞维持培养基（RPMI 1640 (10% FBS，1% Antibiotic-Antimycotic））
Ø 体式显微镜
Ø 生物安全柜
Ø 无菌15mL离心管
Ø 恒温水浴锅
Ø 37℃/ 5% CO2培养箱
Ø 非TC-treated 100mm细胞培养皿
Ø 胶原包被培养皿
Ø 移液枪及宽口移液枪头
Ø AO/PI染料
Ø 0.25% trypsin-EDTA
Ø GSIS试剂盒
III细胞转运
1. 通过胶原酶灌注法分离得到胰腺细胞悬液。
2. 通过体式显微镜进行人工挑选，获得高纯度的胰岛团细胞。
3. 双尿腙染色法确定胰岛细胞纯度。利用AO/PI活死细胞染色确定胰岛活力和形态是否达到发货要求。
4. 胰岛细胞装在15mL离心管中（低温运输），通过高铁或空运至研究者的实验室。
5. 本品为无菌包装，2-8℃低温保存和运输；从包装到重新培养的冷保存时间不超过24 h。
IV 收到细胞后的处理
1. 收到细胞后用75%酒精对外包装进行消毒，转移至生物安全柜中。
2. 离心（100g，4℃，5分钟），去上清，加入适量胰岛细胞维持培养基重悬细胞。
3. 用移液枪将胰岛小心吸出，加至新的35 mm无菌培养皿，或者6孔板中（不超过300个胰岛/孔），每孔加3 mL胰岛培养液；或加至12孔板中（不超过 300个胰岛/孔），每孔加2mL培养液；在37℃5%CO2条件下进行无菌培养；培养时间建议不超过7日，每3天换液1次。
4. 加入新鲜的维持培养基，待用。
V 细胞培养
1. 将胰岛维持培养基于37℃恒温水浴锅中预热20min。
2. 生物安全柜中，在非TC-treated 100mm细胞培养皿中加入10mL胰岛细胞维持培养基，备用。
3. 取适量新鲜的胰岛细胞，用AO/PI染色观察胰岛细胞的死活情况。
4. 悬浮培养：按照客户铺板要求，将细胞铺板到非TC-treated 100mm细胞培养皿，胰岛细胞培养的密度建议为10~20个/mL胰岛细胞维持培养基，3~4天半量换液，7天一次全量换液。请尽快完成实验。
5. 贴壁培养：按照客户铺板要求，将细胞铺板到胶原包被100mm细胞培养皿，每2天换液1次。可用胰酶进行传代，可传2-3代。
VI GSIS葡萄糖刺激下的胰岛素分泌实验
1. 溶液准备
（1）Krebs缓冲储备液
成分 | 用量(g/L) |
HEPES粉末 | 5.955 |
NaCl | 6.721 |
NaHCO3 | 2.012 |
KCl | 0.373 |
MgCl2.6H2O | 0.203 |
CaCl2 | 0.276 |
BSA | 1.000 |
去离子水 | 定容至1L |
测定缓冲液的PH值，如果PH值不在7.4±0.05，可用1N NaOH或1N HCl调节溶液的PH；配制完成后，在生物安全柜内用0.22μm过滤器过滤和灭菌。
（2）280mM葡萄糖储备液
成分 | 用量 |
葡萄糖 | 2.52g |
Krebs缓冲储备液 | 50mL |
配制的容量可根据需要进行调整，配制完成后，在生物安全柜内用0.22μm过滤器过滤和灭菌；然后分装到灭菌的1.5mL EP管中，每管1mL，放-20℃储存（避免反复冻融）。
（3）28mM葡萄糖储备液（高糖）
成分 | 用量 |
280mM葡萄糖 | 1mL |
Krebs缓冲储备液 | 9mL |
（4）2.8mM葡萄糖储备液（低糖）
成分 | 用量 |
28mM葡萄糖 | 1mL |
Krebs缓冲储备液 | 9mL |
2. 操作步骤
1. 用75%酒精浸泡镊子后用无菌纱布擦拭干净，放在另一块无菌纱布上。
2. 取一个12孔板，设置第一列3个孔，分别为A1，B1，C1，第二列3个孔，分别为A2，B2，C2，第三列3个孔，分别为A3，B3，C3，第四列3个孔，分别为A4，B4，C4。
3. 在第一列孔板A1，B1，C1中放入直径12mm，孔径0.4μm的筛网，A1，A2，A3，B1，B2，B3，C1，C2，C3都加入1mL低糖葡萄糖储备液；A4，B4，C4加入1mL高糖储备液（加储备液时，沿孔壁加入并往筛网中轻轻加少许储备液，起到平衡的作用，注意枪头不要戳到筛网底部，容易戳坏）。
4. 将需要刺激的胰岛吸到筛网中（尽量不要吸取培养基），适当摇晃一下清洗，用镊子提起筛网，放在无菌纱布上吸干液体，放到A2，B2，C2中，然后放入37℃/5% CO2培养箱中浸泡1h（目的是让胰岛适应该环境）。
5. 1h后再用镊子提起筛网，放在无菌纱布上吸干液体，再放入A3，B3，C3中，然后放入37℃/5% CO2培养箱中刺激1h；
6. 在刺激的这1h中，准备好足够的无菌1.5mL EP管，做好标记；
7. 1h后，从培养箱中取出12孔板，沿孔壁和筛网的缝隙中吸出刺激液，并放入标记好的EP管中，然后用镊子提起筛网，放在无菌纱布上吸干液体，再放入A4，B4，C4中，然后放入37℃/5% CO2培养箱中刺激1h。
8. 1h后，从培养箱中取出12孔板，沿孔壁和筛网的缝隙中吸出刺激液，并放入标记好的EP管中，吸出刺激液后，往A4，B4，C4中加入1mL RPMI1640（10%FBS+1%Anti-Anti），放入37℃/5% CO2培养箱中培养，装了样并标记好的EP管放到-20℃指定地存放（一周内检测的可放在4℃冰箱存放）。
9. Elisa试剂盒检测上清中的胰岛素含量。
VII 胰岛细胞移植
根据不同受体和移植位点的需求或者具体实验要求，挑取指胰岛当量（IEQ）的胰岛细胞，移植到指定受体的具体移植位点中，每天监测受体的血糖变化和身体状况并作记录。
正常情况下1只C57糖尿病小鼠需要400个胰岛可明显看到降血糖效果。
